A cura di Anna Chiara Giuffrida

La seconda sessione di domenica 11 ottobre è stata dedicata ad una Tavola Rotonda che ha presentato i vari aspetti in cui la biologia molecolare è chiamata in causa per una donna carrier di emofilia, dalla definizione della diagnosi al supporto che può essere offerto nel momento in cui viene pianificata o si affronta una gravidanza. La tavola rotonda è stata introdotta dall’Avv. Cristina Cassone, presidente di FedEmo, che ha fortemente voluto l’inserimento di queste problematiche nel programma del Convegno, e dalla Dr.ssa Angiola Rocino, attuale presidente di AICE.

Il primo contributo è stato offerto dalla Dr.ssa Donata Belvini, che ha aggiornato la platea sulla diagnostica molecolare dell’emofilia. La caratterizzazione genotipica riveste un ruolo fondamentale nella cura dell’emofilia: interessa il paziente (per la relazione tra il genotipo ed il fenotipo emorragico ed rischio di sviluppare l’inibitore), le donne correlate ed è insostituibile nella diagnostica prenatale. Dopo aver identificato il difetto (di fattore VIII o IX) e la sua gravità , è utile la sua caratterizzazione molecolare.
Per l’emofilia A grave si ricercano in primis le varianti geniche più frequentemente osservate, l’inversione dell’introne 22 e dell’introne 1, successivamente eventuali varianti puntiformi o nel numero di copie. Per l’emofilia A moderata o lieve e per l’emofilia B (indipendentemente dalla gravità  di malattia), non riscontrandosi varianti con maggiore frequenza, viene effettuata direttamente la ricerca delle varianti.

La Dr.ssa Belvini ha quindi illustrato le metodiche di sequenziamento, evidenziandone le differenze. Il sequenziamento sec. Sanger ed il sequenziamento NGS (Next Generation Sequencing) sono simili, tuttavia la seconda metodica sequenzia milioni di frammenti simultaneamente, ha una maggiore sensibilità  nel rilevare varianti a bassa frequenza, è più rapida, può sequenziare da centinaia a migliaia di geni contemporaneamente cosi come permette di studiare più pazienti. Il metodo NGS può sequenziare l’intero genoma, l’intero esoma od essere mirato a specifici pannelli genici.
E’ stato precisato inoltre che tra tutti i dati analizzati, è necessario identificare le varianti potenzialmente causative di malattia distinguendole da quelle benigne: ciò è possibile consultando i database di malattia e di popolazione, e con programmi di analisi automatica.
La consultazione dei database è particolarmente importante per le varianti missense e di splicing, in quanto consente di verificare se la variante identificata è stata precedentemente riportata in pazienti con emofilia e quindi essere ragionevolmente la variante causale di malattia. Una variante riportata anche in soggetti sani della famiglia o nella popolazione generale (quindi non affetta da emofilia) è da ritenersi non causale della malattia.

 

La Dr.ssa Belvini sottolinea che non in tutti i pazienti affetti da emofilia A o B si riesce a trovare la mutazione responsabile di malattia ed in questi casi, prima di tutto, è necessario verificare la corretta diagnosi fenotipica (escludendo malattie simili dal punto di vista del fenotipo ma con genetica differente). Poi, la mancata identificazione della variante causativa può essere attribuibile a particolari posizioni della variante nel gene, all’appropriatezza della tecnica di analisi molecolare o ad eventuale mosaicismo (in questo caso il paziente manifesta i sintomi ma la mutazione non è riscontrabile nelle cellule del sangue periferico).

La diagnosi molecolare è fondamentale per la diagnosi prenatale, per cui è fondamentale conoscere la variante familiare prima di una gravidanza e non trovarsi nella situazione di dover procedere alla ricerca della variante a gravidanza già  in essere. In corso di gravidanza si dovrebbe effettuare la diagnosi di sesso fetale con test non invasivi attraverso un prelievo di sangue materno, anche per escludere le principali aneuploidie. Qualora il feto risulti di sesso maschile, la donna sarà  indirizzata alla villocentesi od amniocentesi per la ricerca della variante familiare.

La Dott.ssa Belvini conclude sottolineando che vista la complessità  e la continua evoluzione del settore, sono necessarie delle Linee Guida aggiornate e il Gruppo di Lavoro Genetica dell’AICE sta procedendo in tal senso, a partire dalla diagnosi molecolare dell’emofilia B.

La Dr.ssa Federica Riccardi ha poi affrontato il tema del supporto alle portatrici che i Centri Emofilia italiani sono in grado di offrire. Nella primavera scorsa è stata promossa una Survey sul sito aiceonline.org per conoscere lo “stato dell’arte” dei Centri Emofilia in merito alla gestione delle portatrici di emofilia. La Dr.ssa Riccardi ha cosi mostrato i risultati ottenuti da 37 Centri,  evidenziando come tutti i Centri siano in grado di offrire una consulenza pre-concezionale, mentre un percorso specifico per una consulenza genetica è disponibile con il supporto di 14 servizi di genetica medica, la maggioranza con sede in Italia settentrionale. La gestione della gravidanza delle donne portatrici di emofilia avviene in genere presso lo stesso ospedale sede del Centro.

La maggioranza dei medici dei Centri emofilia italiani si sono dichiarati in grado di fornire adeguate informazioni riguardo alle tecniche invasive disponibili per la diagnosi prenatale (villo/amniocentesi), mentre minori sono le conoscenze riguardo ad approcci più recentemente sviluppati come i test non invasivi (NIPT) e la diagnosi pre-impianto.
La survey è stata l’occasione per verificare le informazioni relative ai Laboratori specialistici che effettuano la diagnosi molecolare di emofilia e ai quali sia possibile rivolgersi per la diagnosi prenatale, 7 sul territorio nazionale.

In parallelo la Dr.ssa Riccardi si è occupata personalmente di un’indagine conoscitiva sui Centri pubblici e privati convenzionati dove sia possibile effettuare diagnosi pre-impianto nell’ambito di percorsi di procreazione medicalmente assistita (PMA). Le informazioni sono state verificate rivolgendosi direttamente ai Centri, rilevati inizialmente da un elenco disponibile sul sito dell’Istituto Superiore di Sanità .

Tutte le informazioni utili sulla diagnosi prenatale e sui Centri per la diagnosi pre-impianto sono raccolti nel documento che è stato distribuito in occasione del Convegno e pubblicato sul sito AICE qualche giorni prima, dal titolo “Dalla diagnosi di portatrice di emofilia alla diagnosi prenatale e alla diagnosi preimpianto“. Questo manualetto, che aggiorna l’analogo documento prodotto da AICE circa 20 anni fa, potrà  essere molto utile non solo per le donne portatrici, ma anche per gli stessi medici dei Centri emofilia nella pratica clinica quotidiana.

Il Prof. Giuseppe Castaldo ha quindi contribuito con una presentazione registrata sulla consulenza genetica che, per l’emofilia, ha delle peculiarità . L’emofilia è una malattia genetica X-linked e generalmente si manifesta nei maschi. La malattia colpisce raramente le donne e per motivi particolari (mutazione in una donna X-0; in caso di inattivazione estrema dell’X in una portatrice; madre portatrice e padre affetto; mutazione de novo in una portatrice di emofilia). Il punto fondamentale è identificare le carrier, per cui la diagnosi molecolare è essenziale.

Altro momento fondamentale è la diagnosi prenatale. L’emofilia è una patologia attualmente ben gestibile con i trattamenti disponibili e questo è fondamentale, affinché siano dati gli elementi riguardo alla decisione della coppia di portare avanti la gravidanza in caso di maschio affetto. La diagnosi prenatale è in ogni caso utile per la corretta gestione della gravidanza, del parto e del neonato. Va chiarito nel counselling la differente tempistica tra villocentesi ed amniocentesi. I rischi delle due metodiche sono identici se eseguite da personale specializzato, ma la villocentesi viene eseguita più precocemente rispetto all’amniocentesi. E questo ha un sicuro risvolto emotivo. Attualmente è tramontata la possibilità  di analizzare le cellule fetali presenti nel sangue materno; è invece possibile l’analisi del DNA fetale nel sangue materno per la diagnosi di sesso, evitando la diagnosi prenatale nel caso di sesso femminile, oltre alla diagnosi preimpianto.

Il Dr. Castaldo ha concluso presentando dei casi e sottolineando che “I pazienti hanno un orologio… diverso dal nostro”, oltre che un linguaggio differente dal nostro; la consulenza richiede quindi da parte dei professionisti tutto il tempo necessario alla coppia.

Si è quindi focalizzata l’attenzione sulla PMA con l’intervento del Dr. Walter Vegetti.
La PMA è un approccio validato per le coppie ad alto rischio genetico ed il ricorso ad essa sta aumentando a discapito delle tecniche di diagnostica pre-natale. In Italia si è in attesa che il legislatore prenda posizione in merito alla copertura da parte del SSN e si precisi eventualmente per quali malattie genetiche ciò possa avvenire.

Essendo l’emofilia una malattia genetica, è possibile diagnosticarla negli embrioni prima dell’impianto in modo da ridurre drasticamente il rischio per una donna portatrice di avere un figlio affetto. Si ricorre quindi ad una PMA in vitro per disporre degli embrioni per l’analisi genetica e alla diagnosi preimpianto (PGD) o, secondo la attuale definizione, a test genetico pre-impianto per malattia monogenica (PGT-M) per coppie a rischio di trasmissione di malattia genetica. La metodica richiede in primis la stimolazione ormonale della donna ed il monitoraggio ecografico; segue il prelievo degli ovociti sotto controllo ecografico e la microiniezione intracitoplasmatica per la fecondazione, quindi la coltura a blastocisti. In quinta-sesta giornata si esegue la biopsia del trofoectoderma. La blastocisti che non risulta affetta al PGT-M viene quindi trasferita nell’utero.

Il Dott. Vegetti ha poi ricordato i differenti articoli della Legge 40/2004 e le successive sentenze per cui, di fatto, si riconosce il diritto di una coppia portatrice di una grave patologia trasmissibile di accedere alla PMA con diagnosi preimpianto. Ha concluso la presentazione con riferendo dell’esperienza del proprio centro (Clinica Universitaria Mangiagalli, Milano).

La sessione si è conclusa con l’intervento di Francesco Cucuzza, membro del Consiglio Direttivo FedEmo che ha presentato il un progetto proposto da FedEmo riguardo alla PMA e alla sensibilizzazione circa la diagnosi preimpianto.